Moleküler Sitogenetik Yöntemler

Moleküler sitogenetik yöntemler nedir?

Moleküler sitogenetik, kromozomların sayısal ve yapısal olarak incelenmesidir.

Klasik sitogenetik yöntemlere göre avantajı, klasik yöntem ile ayırt edilemeyen mikrodelesyon, duplikasyon veya translokasyonların da moleküler yöntemler ile ayırt edilebilmesidir.

Bu ana başlık içerisinde FISH (Fluorescent In Situ Hybridization), aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization) ve NGS (Next Generation Sequencing) gibi metodlar mevcuttur.

Moleküler sitogenetik yöntemlerin embriyoda uygulanması ile embriyolar rahim içerisine transfer edilmeden önce kromozomal olarak test edilmiş olur.

Bu nedenle embriyoda bu testlerin uygulanmasına preimplantasyon genetik test (PGT) – implantasyon öncesi yapılan genetik test – adı verilir.

Bu testin alt başlıklarında yer alan PGT-A, aneuploidi için PGT anlamına gelmektedir.

Yani diğer bir ifade ile embriyodaki kromozom sayısının normal olup olmadığı PGT-A yöntemi ile tespit edilir.

Böylelikle trizomi 21 (Down Sendromu) gibi pek çok kromozomal sorun embriyo rahim içerisine transfer edilmeden önce tanınmış olur.

PGT yöntemleri içerisinde yer alan diğer iki başlık olan PGT-M ile SMA, talasemi ve nörofibromatozis gibi monogenik yani tek gen hastalıkları ayırt edilebilirken, PGT-SR yöntemi ile kromozomal translokasyonları olan çiftlerde embriyolar transfer öncesinde test edilerek sağlıklı gebeliklere ve canlı doğumlara ulaşmak mümkün olabilmektedir.

Moleküler sitogenetik yöntemler ve embriyoda uygulanan genetik testler kimler için uygundur?

Tüp bebek işlemlerinde sadece gebelik eldesi değil, gebeliğin sağlıkla devam etmesi ve sağlıklı canlı doğuma ulaşmak temel hedeftir.

Bunun için embriyo transferi öncesi doğru embriyonun seçimi büyük önem taşımaktadır.

Embriyo seçiminde blastokist kültürü, embriyoskop kullanımı, yapay zeka gibi tekniklerin yanı sıra preimplantasyon genetik testler ve moleküler sitogenetik yöntemler kullanılabilmektedir.

Bu yöntemlerin tamamı çiftlerden detaylı öykü alınması sonrası özellikle aşağıdaki gruplara önerilmektedir:

İleri anne yaşı

Tekrarlayan gebelik kaybı öyküsü

Tekrarlayan tüp bebek başarısızlığı

Şiddetli erkek faktörü

Bilinen bir tek gen hastalığı taşıyıcılığı

Bilinen bir translokasyon taşıyıcılığı

Önceki gebeliklerde fetal yapısal anomali veya kromozomal hastalık öyküsü

Elbette bu grup dışında tüm çiftlere gebeliğe ulaşma süresini kısaltmak veya isteğe bağlı olarak bu yöntemlerden herhangi biri uygulanabilmektedir.

Moleküler sitogenetik yöntemler nelerdir?

FISH

aCGH

NGS

FISH Nedir?

Fluoresan In Situ Hibridizasyon (FISH) yöntemi, hücrelerdeki spesifik DNA parçalarını tespit etmek için kullanılan moleküler bir tekniktir.

Bu yöntemde, hücrelerin içinde bulunan DNA’yı görünür hale getirmek için floresan boyalar kullanılır.

Bu sayede, hücrelerdeki belirli DNA parçalarının nerede bulunduğu ve ne kadar yoğun olduğu tespit edilebilir.

Tüp bebek tedavisinde FISH yöntemi, embriyoların kromozom sayısını ve yapısını kontrol etmek için kullanılır.

FISH yöntemi ile 23 çift kromozomdan cinsiyet kromozomları da dahil olmak üzere 3 veya 5 kromozom çiftini değerlendirmek mümkündür.

Böylelikle embriyonun cinsiyetini ve monozomi veya trizomi 13, 18, 21 gibi özellikli sendromların tanısını koymak mümkün olabilmektedir.

Ek olarak translokasyon taşıyıcılığı olan bireylerde embriyonun genetik yapısını değerlendirebilmek ve sağlıklı kromozom yapısına sahip embriyoların seçimini sağlayabilmek için bölgeye spesifik probların kullanımı ve FISH yöntemi ile embriyo seçimi yapmak mümkündür.

FISH yöntemi ile alınan biyopsilerin sonuçlarının alınması yaklaşık 24 saat sürmektedir.

Bu nedenle sonuçlar alındıktan sonra aynı siklusta taze transfer yapmak mümkündür.

CGH yöntemi nedir? / Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon nedir?

aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization – Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon) yöntemi, hücrelerin kromozomlarındaki DNA’nın yapısını ve düzenini incelemek için kullanılan bir tekniktir.

Bu yöntem embriyodaki 23 çift kromozomun tümünün sayısal ve yapısal olarak incelenmesini sağlayabilmektedir.

Yöntemin temeli, embriyonun DNA yapısının normal olduğu bilinen DNA yapısı ile karşılaştırılması esasına dayanır.

Tüp bebek tedavisinde aCGH yöntemi, embriyoların kromozomlarının yapısını ve düzenini incelemek için kullanılır.

Embriyoların kromozomlarının yapısı ve düzeni, embriyonun gelişimine ve sağlığına etki etmesinin yanı sıra oluşacak gebeliklerin sağlıkla ilerlemesine de katkıda bulunur.

Bu nedenle tüp bebek tedavisinde embriyoların seçimi sırasında aCGH yönteminin kullanılması ile en sağlıklı ve en iyi gelişme potansiyeline sahip embriyolar seçilir.

Böylelikle tüp bebek tedavisinin başarı oranı artırılmaya çalışılır.

Günümüzde aCGH yerine embriyoların kromozomal yapısının incelenmesinde en son teknik olarak NGS (Next Generation Sequencing) kullanımı ön plana çıkmıştır.

NGS Nedir?

NGS (Next Generation Sequencing), günümüzde preimplantasyon genetik test (PGT) yöntemleri içerisinde bilinen en yeni tekniktir.

NGS – Yeni Nesil Dizileme tekniği sayesinde embriyolardaki yapısal ve sayısal anormalliklerin tespit edilmesi mümkündür.

Bu teknikte öncelikle elde edilen örneğin DNA’sı amplifiye edilir, ardından enzimatik olarak parçalanarak elde edilen DNA dizileri okunur.

Böylelikle her bir embriyoya ait toplam okuma sayısı belirlenir.

Bu yöntem daha önce kullanılan yöntemlere nazaran daha hassas bir ölçüm tekniğidir ve doğruluk oranı çok daha yüksektir.

Bu yöntem sayesinde embriyolarda kromozomal mozaisizmin tanınma şansı da artmıştır.

NGS testinin sonucunda embriyolara 3 farklı sonuç verilmektedir.

Euploid (normal): Embriyoda 46 tane kromozom bulunmaktadır ve kromozomlar yapısal olarak normaldir. Bu embriyolar transfer edilebilir.

Aneuploid (anormal): Embriyodaki kromozom sayısı 46’dan farklıdır. Bu embriyoların transferi yapılamaz.

Mozaik: Embriyodan örnek alınan hücrelerde normal ve anormal kromozom sayısına sahip hücreler bir arada bulunmaktadır. Embriyoda tespit edilen mozaiklik oranı ve tipine göre, çiftin başka normal embriyosu yoksa transfer edilebilir.

Moleküler sitogenetik yöntemler yapılmadan gerçekleştirilen embriyo transferlerinde, eğer embriyo yapısal olarak aneuploid yani anormal ise ve test yapılmadığı için bu durum bilinmiyorsa üç potansiyel sonuçla karşılaşılabilir.

Embriyonun rahim içerisine hiç tutunmaması yani gebelik elde edilememesi

Embriyonun rahim içerisine tutunmasına rağmen erken gebelik haftalarında gebeliğin sonlanması

Gebeliğin oluşması fakat ilerleyen gebelik haftalarında tarama ya da tanı testlerinde fetüste anomalilerin tespit edilmesi

Tüm bu olumsuz sonuçlardan kaçınmak için günümüzde pek çok çift sıklıkla preimplantasyon genetik tanı yöntemlerine yönelmektedir.

Anne yaşının genç olduğu ve donör oosit kullanıldığı durumlarda kromozomal anormallik oranı son derece düşük olmakla beraber tamamen yok sayılamaz.

Bu nedenle yukarıda belirtilen endikasyonların dışında çiftler kendi istemleri ile de embriyolarına bu testleri yaptırabilme şansına sahiptir.

Yine de bu testlerin kromozomal hastalıklar dışında yer alan gen hastalıklarını ayırt etmediği ve bu hastalıkların taranması için ek testler yapılması gerektiği unutulmamalıdır.

NGS tekniği uygulandığında sonuçlar yaklaşık 14 gün içerisinde elde edilmektedir.

Bu nedenle biyopsi işlemi sonrasında embriyolar dondurularak sonuçların alınması beklenir.

Sonuç elde edildiğinde dondurulan embriyoların çözülerek rahim içerisine transferi için yaklaşık 20 gün süren bir hazırlık dönemine girilir.

Rahim içi hazırlık tamamlandığında sağlıklı kromozom yapısına sahip olduğu bilinen embriyolar çözülerek rahim içerisine transfer edilir.